Gram négatif

Les bactéries à Gram négatif sont mises en évidence par une technique de coloration nommée coloration de Gram. Les bactéries à Gram négatif apparaissent alors roses au microscope. La technique de coloration repose sur les caractéristiques membranaires et de paroi de la bactérie. La coloration de Gram est un facteur déterminant dans la taxonomie (classification) bactérienne.

Principe de coloration des Gram négatif

Après fixation des bactéries sur une lame (deux méthodes envisageables : fixation à l'éthanol à 90° (5 minutes) ou par passage de la lame dans la flamme, dite frottis)  :

• La lame est plongée dans un premier colorant : le violet de gentiane (1 minute). Le violet de gentiane est un colorant puissant, (toxique et cancérigène). Il va traverser les parois et membranes des bactéries et se fixer dans leurs cytoplasmes. Ainsi à cette étape l'ensemble des cellules sont colorées en violet.
• La lame est ensuite traitée au lugol (diiode) en solution qui sert de mordant (30 secondes)  : il va renforcer le violet de gentiane contenu dans le cytoplasme des bactéries.
• On chasse ensuite le violet avec une solution d'éthanol à 90°. Cette étape est principale car sert à discriminer les bactériesGram négatif des bactéries Gram positif. Le principe est le suivant : les bactéries Gram négatif possèdent une paroi pauvre en peptidoglycane, composant qui à cause de sa faible quantité va permettre à l'alcool d'emporter le violet de gentiane, ce dernier disparaissant du cytoplasme. La bactérie est par conséquent décolorée (pour plus d'information, voir les caractéristiques des bactéries Gram négatif).

• La lame, après avoir été rincée, est plongée brièvement dans un deuxième colorant, la fuchsine (1 minute). Ce colorant traverse l'ensemble des parois et membranes et va colorer en rose l'ensemble des bactéries qui ont été décolorées durant l'étape précédente ; les bactéries Gram positif étant colorées en violet (plus sombre) n'apparaîtront pas rose (plus clair).

La lame est ensuite récupérée, rincée et séchée, puis observée au microscope optique le plus souvent à l'objectif x100 + huile à immersion. Les bactéries Gram négatif apparaîtront en rose. L'observation de leur couleur est le plus souvent accompagnée de descriptions structurelles (ex. bacille ou coque).

Description de l'enveloppe

Les bactéries Gram négatif ont une structure qui s'organise en trois grandes parties, soit, de l'extérieur vers l'intérieur,  :

• La membrane externe,
• L'espace périplasmique, comportant surtout la paroi,
• La membrane plasmique.

La membrane externe est en contact direct avec le milieu extérieur. Elle est essentiellement composée de phospholipides organisés en bicouche (partie hydrophile à l'extérieur et partie lipophile à l'intérieur) mais contient aussi de nombreuses protéines intrinsèques, surtout les protéines de transports nommées porines. Énormément de bactéries Gram négatif (par exemple Salmonella) possèdent aussi un composé non protidique nommé lipopolysaccharide ou LPS ; ce composé peu immunogène, dont le pouvoir pathogène (lipide A) est inclus dans la membrane externe, s'active lors de la lyse de la bactérie. La membrane externe est reliée au peptidoglycane par la lipoprotéine de Braun.

L'espace périplasmique est un espace de stockage d'enzymes, de nutriments... Il a énormément d'autres fonctions, surtout dans certaines étapes de la synthèse des protéines et dans le métabolisme. Il se situe entre la membrane externe et la membrane plasmique et il contient une couche de peptidoglycanes. La couche de peptidoglycane (appelé aussi muréine) est assez mince chez les Gram négatif contrairement aux Gram positif.

La membrane plasmique est comparable à la membrane externe (excepté le LPS). Elle possède des protéines poreuses aboutissant dans l'espace périplasmique (synthèse des protéines). La membrane plasmique contient de nombreux autres complexes protéiques d'une importance vitale pour la bactérie (comme l'ATP synthase) qui ont des rôles prépondérants dans le métabolisme bactérien.

Exemples de bactéries Gram négatif

• Famille des Enterobacteriaceæ :
  • Genre Salmonella
  • Espèce Escherichia coli
  • Espèce Yersinia pestis (responsable de la peste)
• Famille des Vibrionaceæ :
  • Espèce Vibrio choleræ (responsable du choléra)
• Famille des Pseudomonadaceæ  :
  • Genre Pseudomonas
• Famille de Neisseriaceæ
  • Espèce Neisseria meningitidis (responsable de la méningite bactérienne)

Voir aussi

• Gram positif.

• Les mycobactéries : une exception car non colorable par la méthode de Gram car acido-alcoolo-résistantes.

Voir coloration de Ziehl-Neelsen.

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